2018年11月29日，汪方炜实验室在The Journal of Biological Chemistry杂志在线发表题为“A positive feedback mechanism ensures proper assembly of the functional inner centromere during mitosis in human cells”的研究论文，揭示了有丝分裂期着丝粒组装的正反馈调控机制。
染色体的正确分离依赖于姐妹染色体粘连（sister chromatid cohesion）以及动粒（kinetochore）与纺锤体微管（spindle microtubule）连接的动态调控。作为染色体上高度特化的重要功能区，着丝粒（centromere）不仅是动粒组装的基础，也是有丝分裂期姐妹染色体粘连的主要部位。通过招募数十种蛋白，着丝粒的内层（inner centromere）在调节姐妹染色体粘连和动粒-微管的连接中发挥重要作用。内层着丝粒结构和功能的缺陷会造成染色体错误分离，进而导致染色体的不稳定性。而染色体不稳定性不仅是癌细胞的常见特征，还能促进肿瘤的发生和发展（Bakhoum F et al., Nature, 2018）。但是，调控内层着丝粒组装的具体分子机制尚不清楚。
Shugoshin（日语中意为“守护神”）是染色体稳定性的重要保护者。在体细胞中利用RNA干扰技术敲减Shugoshin家族Shugoshin-1（简称Sgo1）蛋白的表达会导致姐妹染色体粘连的丧失和着丝粒结构的严重破坏，这给Sgo1调控着丝粒组装的机理研究造成了很大的困难。博士生梁材利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，结合单链寡脱氧核糖核苷酸（single-stranded DNA oligonucleotides/ssODN）作为DNA损伤后同源定向修复的供体模板，在一株染色体相对比较稳定的人宫颈癌HeLa细胞中实现了对Sgo1基因的精准突变，即将Sgo1蛋白第492位赖氨酸残基突变为丙氨酸（简称K492A）。带有K492A突变的Sgo1失去对第120位苏氨酸磷酸化的组蛋白H2A（H2ApT120）的结合能力，并且不能像野生型Sgo1那样定位于染色体的着丝粒区。博士生张振蕾利用活细胞显微成像技术实时追踪并比较了野生型和Sgo1-K492A突变体细胞在有丝分裂期的命运，发现突变体细胞中染色体错误分离的比例明显增加（即染色体不稳定性）。而且，突变体细胞的增殖偏慢，并表现出对低浓度化疗药物紫杉醇（paclitaxel）的敏感性。
利用荧光显微技术对有丝分裂期染色体的观察发现，Sgo1-K492A突变体细胞的内层着丝粒有明显的缺陷，主要表现为该区域姐妹染色体粘连变弱和染色体乘客复合体（chromosomal passenger complex/CPC；动粒-微管连接的重要调节者）富集程度的下降。接着，梁材同学通过表达Sgo1与着丝粒结构蛋白CENP-B的融合体，将多种不同类型的外源Sgo1突变体人为地定位至突变体细胞的着丝粒区，进而分析内层着丝粒结构和功能缺陷的修复情况。实验结果显示，Sgo1与蛋白磷酸酶PP2A的结合不仅对于姐妹着丝粒粘连是重要的，而且能促进CPC在着丝粒的定位。进一步的机理研究表明，Sgo1通过结合PP2A保护了着丝粒区的黏连蛋白复合体（cohesin；姐妹染色体粘连的介导者），cohesin则通过其Pds5B亚基结合蛋白激酶Haspin，进而，Haspin一方面通过拮抗Wapl（cohesin的破坏者）增强姐妹着丝粒的粘连，另一方面通过磷酸化组蛋白H3促进CPC在着丝粒区的富集。
基于这一系列实验结果，并结合国外同行关于cohesin可以结合Sgo1的重要发现（Liu H et al., Nat Cell Biol 2013, Curr Biol 2013, Mol Cell 2015; Hara K et al., Nat Struct Mol Biol 2014），论文构建了由Sgo1-cohesin-Haspin构成正反馈调控回路的工作模型（如图所示），阐述了该回路调控内层着丝粒组装的分子机制，并提出了将着丝粒区cohesin的富集程度关联于癌细胞染色体不稳定性的设想。
图释：Sgo1-cohesin-Haspin正反馈回路调控有丝分裂期着丝粒组装的分子机制。
博士生梁材和张振蕾是论文的共同第一作者，陈亲富等其他同学也有重要贡献，汪方炜教授为通讯作者。汪方炜实验室的研究由国家重点研发计划（2017YFA0503600）、国家优秀青年基金（31322032）及国家基金面上项目（31771499、31571393、31371359）、NSFC-RS中英人才基金（31561130155）、英国皇家学会牛顿高级学者基金（NA140075）、浙江省自然科学基金杰青和重点项目（Z19C070003、LR13C070001）、中央高校基本科研业务费专项资金以及永利yl23411官网登录自主科研计划校长专项等资助。
原文链接：http://www.jbc.org/content/early/2018/11/29/jbc.RA118.006046.abstract
